DNA甲基化作為表觀遺傳調(diào)控的核心機制之一，通過對基因表達的精準動態(tài)調(diào)控，深刻影響著生物個體的表型多樣性形成，在性別分化、生長發(fā)育、抗病抗逆及環(huán)境適應等關鍵生命進程中發(fā)揮著不可替代的作用。近年來，基于CRISPR/dCas9的表觀基因編輯技術的出現(xiàn)，為實現(xiàn)特定位點的DNA甲基化精準調(diào)控開辟了革命性途徑。然而，該技術在水生生物尤其是海洋魚類中的應用仍處于初步探索階段，面臨著編輯器效率不穩(wěn)定、調(diào)控效果難以精準驗證、適配海水魚類復雜生理特性的技術體系不完善等諸多挑戰(zhàn)。因此，構(gòu)建一套更穩(wěn)定、可重復、易驗證的海水魚類表觀基因編輯技術體系，已成為當前水產(chǎn)育種領域突破技術瓶頸、推動種質(zhì)創(chuàng)新的迫切需求。

依托國家海洋水產(chǎn)種質(zhì)資源庫，中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所邵長偉研究員團隊以半滑舌鰨和海水青鳉為研究對象，首次在海水魚類中構(gòu)建并優(yōu)化CRISPR/dCas9介導的DNA甲基化編輯技術體系，創(chuàng)建了激活型和抑制型DNA甲基化編輯器，并在技術體系構(gòu)建和作用機制解析方面取得系列研究進展。相關成果發(fā)表于《Zoological Research》《International Journal of Molecular Sciences》等國際學術期刊，并獲授權國家發(fā)明專利《基于CRISPR/dCas9的適用于半滑舌鰨的DNA甲基化編輯系統(tǒng)及其應用》，實現(xiàn)了從機制研究、技術體系構(gòu)建到知識產(chǎn)權布局的有機銜接。

激活型和抑制型DNA甲基化編輯器原理示意圖

2024年，研究團隊首次在海水魚類半滑舌鰨中建立了CRISPR/dCas9介導的抑制型DNA甲基化編輯器及技術體系，以生殖發(fā)育相關基因emx2為靶標，系統(tǒng)驗證了該編輯器在精巢細胞中的可行性。通過靶向提升emx2啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平，顯著抑制其轉(zhuǎn)錄活性，并引發(fā)下游性別分化相關基因的表達改變。編輯效率分析顯示，單獨轉(zhuǎn)染sgRNA1或sgRNA3時，emx2表達量分別下降約2倍，啟動子區(qū)甲基化水平分別提高約30%和15.63%；兩者聯(lián)合轉(zhuǎn)染時，emx2表達下調(diào)約1.35倍，甲基化水平提高約17.51%。此外，對生物信息學預測的潛在脫靶位點進行檢測，未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。該研究首次在半滑舌鰨中實現(xiàn)了對內(nèi)源基因甲基化狀態(tài)的靶向調(diào)控，為后續(xù)表觀遺傳編輯體系的拓展與系統(tǒng)優(yōu)化奠定了技術基礎（International Journal of Molecular Sciences, 2024；CN118291539A）。

半滑舌鰨emx2基因DNA甲基化編輯

近期，研究團隊進一步完善了去甲基化調(diào)控方案，并在海水青鳉中構(gòu)建了更加系統(tǒng)、穩(wěn)定的CRISPR/dCas9-tet1CD介導的激活型DNA甲基化編輯器及技術體系。以生長調(diào)控相關基因fgf2 為研究對象，精確靶向其啟動子CpG島區(qū)域，實現(xiàn)高效去甲基化和轉(zhuǎn)錄激活。結(jié)果顯示，該系統(tǒng)可顯著激活fgf2的轉(zhuǎn)錄活性。其中，Mix1組（sgRNA1+sgRNA2+sgRNA3）和Mix2組（sgRNA2+sgRNA3+sgRNA4+sgRNA5）激活效果最為顯著，表達水平分別提升2.18倍和2.41倍，對應啟動子區(qū)域甲基化水平分別降低22.72%和18.4%，體現(xiàn)出較高的編輯效率與調(diào)控精度。全基因組重亞硫酸鹽測序和轉(zhuǎn)錄組分析進一步表明，該編輯體系未檢測到與sgRNA相關的脫靶基因，整體脫靶率極低。值得注意的是，fgf2的表觀遺傳激活不僅顯著增強了其自身表達，還誘導了多種與細胞生長和發(fā)育相關下游基因的協(xié)同表達變化，并呈現(xiàn)出穩(wěn)定而持久的調(diào)控效應，在dCas9蛋白表達終止9天后仍維持顯著上調(diào)狀態(tài)（Zoological Research, 2026）。

海水青鳉fgf2基因去甲基化編輯

綜上，本研究圍繞重要海水魚類功能基因的表觀遺傳調(diào)控，創(chuàng)建了激活型和抑制型2款表觀編輯器，建立了一套穩(wěn)定、可重復、易驗證的魚類表觀基因編輯技術體系，揭示了表觀遺傳可塑性在魚類生長與發(fā)育調(diào)控中的重要作用，系統(tǒng)展示了表觀編輯技術在魚類中的應用前景。相關成果從技術路徑與分子機制層面深化了對基因調(diào)控規(guī)律的認識，為功能基因組學研究以及水產(chǎn)種質(zhì)資源的精準開發(fā)與高效利用提供了重要理論基礎和技術支撐。

文章鏈接：

Lin, L., Zhang, J., Liu, B., Du, S., Zhang, Y., Yang, Y., Li, C., Dong, C., He, Y., Wang, Q., et al. (2026). Epigenetic editing of marine medaka (Oryzias melastigma) fgf2 using CRISPR/dCas9-Tet1CD. Zoological Research. 10.24272/j.issn.2095-8137.2025.089

Sun, Y., Wang, H., Liu, B., Yue, B., Liu, Q., Liu, Y., Rosa, I., Doretto, L., Han, S., Lin, L., et al. (2024) CRISPR/dCas9-Mediated DNA Methylation Editing on emx2 in Chinese Tongue Sole (Cynoglossus semilaevis) Testis Cells. International Journal of Molecular Sciences 25, 7637. 10.3390/ijms25147637.

邵長偉， 孫衍旭， 王洪巖， 劉冰花， 岳博文， 劉倩， 劉宇巖， 韓圣磊， 林磊。 基于CRISPR/dCas9的適用于半滑舌鰨的DNA甲基化編輯系統(tǒng)及其應用: 中國， CN118291539A[P]. 2024-07-05.